Neveu et successeur de Justin 1er, Justinien 1er a eu pour principal objectif de reconstituer intégralement l'Empire romain, en réunissant les provinces perdues depuis les invasions barbares. D'une nature travailleuse (on le surnomma l'empereur que ne dormait jamais) mais très orgueilleux et méfiant, il subissait l'influence de sa femme, l'impératrice Théodora qui fut l'associée de son règne.

La volonté d'une unification législative et judiciaire est à l'origine du code Justinien (corpus juris civilis) qui a profondément influencé la chrétienté médiévale.

Grâce à des généraux efficaces, comme Bélisaire, il conquiert le royaume Vandale d'Afrique du nord et le royaume Ostrogoth d'Italie. En 560, l'ensemble du monde méditerranéen, hormis la Gaule, est sous domination byzantine. Il parvient à établir la paix avec la Perse Sassanide.

A l'intérieur de l'empire, il doit faire face à divers troubles : en 532, une insurrection, la sédition Nika, est brutalement réprimée, après avoir failli le renverser (un autre empereur, Hypathios, a même été désigné par la foule en colère ; celui-ci est rapidement exécuté). Il semble que le sang froid de l'impératrice Théodora soit pour beaucoup dans le rétablissement de la situation...
Sur le plan religieux, sa tentative de conciliation avec les monophysites (Théodora l'était) tourne court : le pape Vigile (537) rejette catégoriquement le compromis.

Justinien s'est montré un ambitieux bâtisseur (ponts, routes, thermes, défenses...) . La Basilique Sainte-Sophie est construite sous son règne.